Острые лейкозы представляют собой гетерогенную группу опухолевых заболеваний системы крови — гемобластозов, которые характеризуются первичным поражением костного мозга морфологически незрелыми кроветворными (бластными) клетками с вытеснением ими нормальных элементов и инфильтрацией ими различных тканей и органов. Все острые лейкозы клональны, т.е. возникают из одной мутировавшей кроветворной клетки, которая может относиться как к очень ранним, так и к коммитированным в направлении различных линий кроветворения клеткам-предшественницам. Принадлежность бластных клеток к той или иной линии кроветворения, степень их дифференцировки обусловливают клиническое течение острого лейкоза, терапию, эффективность лечения и соответственно прогноз заболевания (Воробьев А.И., 1985; Scheinberg D.A. el al., 1997).
Основополагающим принципом терапии острых лейкозов является применение цитостатических препаратов в адекватной дозе и за определенный отрезок времени с целью как можно более быстрой и полной эрадикации лейкемического клона, восстановлении нормального кроветворения и достижение длительной безрецидивной выживаемости.
Одним из наиболее прогрессивных методов терапии острых лейкозов, в первую очередь резистентных и относящихся к группам повышенного риска раннего рецидивирования, является аллогенная ТГСК.
Безрецидивная выживаемость при остром миелобластном лейкозе (ОМЛ) после аллоТГСК составляет 50-70% у детей и взрослых, при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) — 50-60% у взрослых и у детей во второй ремиссии заболевания, что свидетельствует о высокой эффективности данного метода лечения.
Большинство авторов отмечают, что результат ТГСК зависит от состояния системы гемостаза, (Nurnberger W. et al., 1997; Tamaki S. et al., 2002; Matsumoto T. et al., 2004). Её изменения обусловлены поступлением в кровоток из опухолевых клеток и поврежденного эндотелия тканевого фактора, образующего комплекс с фактором VII, активизирующего факторы IX и X и запускающего процессы внутрисосудистого свертывания крови (Donati М.В., Poggi А., 1980).
Перед исследователями поставлены задачи по оценке частоты и факторов риска развития гемостазиологических осложнений на основании клинических и лабораторных данных: характеристике динамики противосвертывающей системы у больных после трансплантации: выявлению функциональных изменений эндотелия в пострансплантационном периоде; оценке динамики Д-димера как маркера активации свертывания и фибринолиза у больных после трансплантации, а так же составлению программы лабораторного выявления нарушений системы гемостаза у больных после ТГСК.
В рамках обследования выбранной когорты пациентов применялись как скрининговые тесты оценки системы гемостаза (АПТВ, протромбиновое время, фибриноген), тромбоцитарного звена, так и более углубленное исследование с определением отдельных маркеров (Д-димер, фактор Виллебранда, антитромбин, протеин С).
Впервые в России на основании лабораторного и клинического исследования были получены систематизированные данные о состоянии и динамике системы гемостаза у больных острыми лейкозами в ходе аллогенной трансплантации. Определены клинические и лабораторные факторы риска развития, осложнений в системе гемостаза. Впервые была изучена реакция эндотелиальных клеток на проводимую терапию.
В ходе выполнения первой задачи по определению частоты развития и выявлению факторов риска возникновения* гемостазиологических осложнений у больных с острыми лейкозами в посттрансплантационном периоде у всех обследованных пациентов выявлены нарушения гемостаза, клинически сопровождающиеся геморрагическим синдромом. При структурировании гемостазиологических нарушений выявлено, что минимальный кожный геморрагический синдром наблюдается у 100% пациентов, а выраженный кожный геморрагический синдром у 45,7%).
Острый и скрытый ДВС-синдром, определённый согласно критериям, разработанным научным комитетом стандартизации Международного сообщества по тромбозам и гемостазу, по частоте развития находится на втором месте.
У 22,8% пациентов нарушения гемостаза клинически выражались в виде тромботических изменений (веноокклюзионная болезнь печени, тромбоэмболия ветвей лёгочной артерии).
У пятой части в данной когорте пациентов встречались кровоизлияния во внутренние органы (желудочно-кишечный тракт, лёгочное кровотечение, ОНМК по геморрагическому типу), зачастую явившиеся фатальными.
Наиболее часто развитие геморрагического цистита ассоциировалось с вирусной этиологией и находится на пятом месте по встречаемости.
Полученные данные перекликаются с результатами, опубликованными в зарубежной литературе. В исследовании Dixit A. et al. (2007) из 67 пациентов (больные OJ1 в индукции ремиссии), у 40% из них ДВС был чётко диагностирован, согласно критериям Международного сообщества, по тромбозам и гемостазу. Данные Uchiumi Н. et al. (2007) также подтверждают значимость ДВС в структуре гемостазиологических нарушений. Из 161 пациента с ОМЛ (не МЗ-вариант), у 52 был диагностирован ДВС (32%). Согласно международным критериям Uderzo С. et al. (1993) у 3 из 67 детей с ОЛ в первый месяц после ТКМ выявил развитие тромбоэмболии лёгочных сосудов, подтверждённых сцинттиграфией и/или ангиографией. Обследовав 58 больных с ОЛ, Sarris А.Н. et al. (1992) отметил у 13 тяжёлый геморрагический синдром (ТЭЛА, тромбоз сагиттального синуса), являвшийся основной причиной смерти.
Среди возможных факторов риска развития гемостазиологических осложнений нам представлялось наиболее вероятным и интересным рассмотреть следующие: зависимость частоты развития осложнений от опухолевого статуса пациента, типа лейкоза, вида трансплантации (родственная или не родственная), интенсивности режима кондиционирования (миелобаблативный и режимы со сниженной миелотоксичностью) и степень РТПХ.
В ходе статистической обработки материала исследования было определено, что достоверно влияют на частоту развития нарушений гемостаза такие факторы, как вид трансплантации, режим кондиционирования и степень РТПХ. Так, при аллогенной неродственной ТГСК частота развития нарушений со стороны системы гемостаза была достоверно выше, чем у реципиентов, имеющих родственных доноров. Причиной такой зависимости может быть большее молекулярно-генетическое несоответствие при использовании неродственного костного мозга. Несмотря на тщательный подбор донорских ГСК, не всегда удается сохранить соответствие по всем параметрам, некоторые из которых пока даже не входят в программу тесшровапия гр^пп ГСК па соответствие. Комплекс нарушений в иммунном статусе сказывается и на функционировании системы гемостаза. Клинической результирующей является дстоверное увеличение частоты коагуляционных осложнений при неродственной трансплантации.
Аналогичную картину мы наблюдали при использовании различных режимов кондиционирования. Более «жесткие» миелоаблативные режимы кондиционирования достоверно чаще сопровождались геморрагическими и тромбоэмболичесими ослолснениями, нежели режимы кондиционирования со сниженной миелотоксичностью. Это объясняется с нашей точки зрения более глубокой супрессией костного мозга, в том числе мегакариоцитарного ростка и, возможно, больщей степенью повреждения эндотелия с вытекающей из этого активацией свертывания и клиническими проявлениями тромбинемии.
Нам представляется важным результат, полученный при оценке влияния реакции «трансплантат против хозяина» на частоту коагуляционных осложнений. Рассматривая РТПХ, как одну из значимых причин неудач трансплантации ГСК, необходимо учитывать, что по нашим данным, наиболее выраженные изменения системы гемостаза, сопровождавшиеся клиническими значимыми геморрагическими и тромбоэмболическими проявлениями, наблюдались у пациентов с II и выше степенью реакции «трансплантат против хозяина», в то время как у реципиентов с лёгкой степенью острой РТПХ данные нарушения встречались достоверно реже. При изучении литературы нами обнаружены немногочисленные сведения по данному вопросу. Исследуя больных после ТГСК Kanamori Н. et al. (1998) выявил, что нарушения гемостаза у пациентов с РТПХ II-IV степени значимо отличались от пациентов легкой степени. Полученные результаты позволяют предположить и обратную причинно-следственную связь: протромботическое состояние и повреждение эндотелия может быть вызвано режимом кондиционирования и/или РТПХ. Лабораторным подтверждением служит динамика уровня Д-димера и фактора Виллебранда в посттрансплантационном периоде.
Несколько неожиданным результатом явилось отсутствие корреляции осложнений со стороны системы гемостаза, опухолевого статуса и типа острого лейкоза. Оказалось, что состояние ремиссии или рецидива, а также характер поврежденного ростка кроветворения не являются факторами риска геморрагических и тромботических осложнений. Как пациенты, находящиеся в ремиссии острого лейкоза, так и больные в рецидиве или прогрессии основного заболевания, имели одинаковую частоту развития нарушений со стороны системы гемостаза, а частота гемостазиологических осложнений у пациентов с ОМЛ и ОЛЛ достоверно не отличалась. Вероятно, полученные результаты именно по этим параметрам нельзя считать окончательными, и необходимы дополнительные исследования на большей выборке пациентов. Например, Dixit A. et al. (2007) оценивали 67 пациентов и при диагностике у 40% из них ДВС отметили, что в группе ОМЛ синдром ДВС развивался и ассоциациировался с геморрагическим синдромом чаще. Это было, вероятнее всего, обусловлено преобладанием в данной группе пациентов с МЗ-вариантом ОМЛ.
Полученные результаты по отдельным параметрам гемостаза должны рассматриваться комплексно для воссоздания полной картины нарушений. Действительно, наблюдавшееся ингибирование протеина С в комплексе с неуклонным нарастанием повреждения эндотелия (повышении антигена фактора Виллебранда) складывается в единую систему причин развития гемостазиологических нарушений. В рамках данной работы не изучалось состояние тромбомодулина, который является неотъемлимой частью системы протеина С и участником «запуска» функционирования системы, однако необходимо учитывать, что синтез тромбомодулина происходит в сосудистой стенке. При ее дисфункции (а это подтверждено динамикой фактора Виллебранда) синтез и экскреция тромбомодулина из эндотелиальных клеток может быть нарушен с последующим страданием и недостаточностью функции системы протеин С-протеин S. В сниясение содержания протеина С может вносить вклад и нарушение печеночной функции. Вряд ли можно объяснить такое снижение потреблением этого антикоагулянтного белка. Мы не видели реакции потребления и на примере антитромбина. Наоборот, в первые сутки после трансплантации антитромбин даже повышался в целом по уровню средних величин по всей обследованной группе. Далее происходило его снижение.
При проведении сравнительного статистического анализа в общей выборке, без подразделения по нозологии были получены статистически значимые различия концентрации антитромбина III в следующих точках: исходный уровень и Д0, Д0 и через две недели после трансплантации, Д+14 и начала функционирования донорского костного мозга (р<0,01). В исследовании проводимом Nurnberger W. el al. (1997) на 50 иациешах после аллоТКМ продемонстрировано повышенное потребление AT на Д+14. Истощение резервов физиологических антикоагулянтов вероятнее всего связано с выраженной активация свертывающей системы крови с образованием избыточного количества тромбина. Сведений об изменении уровня антитромбина при ТКСК в зависимости от формы острого лейкоза в доступной литературе обнаружить не удалось. Проведенный нами анализ показал, что достоверность в динамике антитромбина присущи обоим типам OJI, а при сравнении групп ОЛЛ и ОМЛ достоверных различий не было получено.
Однако следует заметить, что все изменения происходили в рамках референсных значений. Возможно на такой «смазанный» характер потребления противосвертывающих белков при развитии синдрома ДВС повлияла мощная инфузионная терапия, включавшая в том числе переливание плазмы. Появляющийся дефицит сразу восполнялся и мы не получили развернутой картины ДВС с потреблением естественных антикоагулянтов.
Известно, что система протеина С, которая вместе с антитромбином III и ингибитором внешнего пути (ИВПС — TFPI) является наиболее важным и эффективным компонентами антикоагуляционной системы, ингибирует активированные кофакторы плазменного гемостаза и соответственно ограничивает процесс свертывания крови.
При проведении сравнительного анализа в общей выборке, без подразделения по нозологии были получены статистически значимые различия концентрации С-протеина в следующих точках: исходный уровень и Д0, исходный уровень и начало функционирования донорского гемопоэза, Д+14 и начала функционирования донорского костного мозга (р<0,05). Наши данные отличались от результатов, полученных Lee J.H. et al. (1998): в исследовании у 30 больных после аллоТКМ различий в уровень протеина С в сравнении с исходным и Д0 получено не было.
В то же время Gordon В. et al. (1991) приводит данные подтверждающие, что на Д+14 отмечалось значительное снижение уровня протеина С (в среднем на 20%). Возможно, это связано не только с их активным потреблением, но и со снижением синтеза в печени, значительно большей активацией фибринолиза, в том числе из-за дефицита а2-антиплазмина. Исследования по изменении протеина С в зависимости от нозологической формы острого лейкоза при ТГСК отсутствуют.
Нами была проанализирована динамика в обеих представленных группах (ОЛЛ и ОМЛ) и отмечено снижение концентрации С-протеина. В группе больных ОМЛ были получены статистически достоверные различия в концентрации С-протеина только между его исходным уровнем и концентрацией на Д0 (р<0,05), а у больных с ОЛЛ статистически значимые различия были выявлены во всех четырех сравниваемых точках.
Дефицит AT и протеина С и повышение фибриногена без сопутствующего усиления фибринолиза создаёт у больных после ТКМ благоприятную почву для развития гиперкоагуляционных состояний с последующими тромботическими осложнениями. Поэтому возрастает потребность в осуществлении тщательного мониторинга состояния системы гемостаза. Возможная причина подобных изменений кроется в массивной химиотерапии, нарушениях функции печени, возникающих в раннем посттрансплантационном периоде у этой тяжелой группы пациентов. Полученные результаты согласуются с литературными источниками. Salat С. (1996) выявил, чю исходно нормальные уровни протеина С значимо снизились и начали восстанавливаться только к моменту приживления донорского костного мозга. Harper P.L. et al. (1990), измеряя естественные антикоагулянты протеин С и протеин S, а так же антитромбин у 21 пациента после ТКМ пришел к заключению, что максимальное снижение пришлось на Д+14. Те же изменения достигали максимума на Д+14 с тенденцией к нормализации восстановления донорского гемопоэза и в исследовании Vannucchi A.M. et al. (1994).
В физиологических условиях эндотелий сосудов продуцирует большое количество биологически активных факторов, которые неразрывно связаны с гомеостазом, фибринолизом, нарушением сосудистого тонуса и проницаемостью сосудов, синтезом факторов роста и т. п. Одним из таких продуктов эндотелия, является фактор Виллебранда (ФВ). В настоящее время фактор Виллебранда — общепризнанный лабораторный маркер эндотелиальной дисфункции.
При динамическом наблюдении за больными, перенесшими аллогенную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток, отмечено повышение содержания фактора Виллебранда (ФВ) с момента проведения кондиционирования до начала функционирования донорского костного мозга.
Повышение содержания фактора Виллебранда с момента кондиционирования и агрессивного химиотерапевтического воздействия на пациента свидетельствовало о системном нарушении эндотелиальной функции с последующим дисбалансом во всех звеньях гемостаза. Выявленные нарушения нарастали и имели тенденцию к стабилизации в целом по группе только к моменту восстановления гемопоэза. Значительные колебания антигена ФВ в широких пределах (исходный уровень — от 34,2% до 376,0%; в точке Д0 — от 18,8% до 420,0%; на 14 сутки — от 20,3% до 483,0% и к моменту восстановления — от 24,5% до 510,0%) не изменил общей динамики нарастания значений за весь период наблюдения. Наиболее высокие значения содержания фактора Виллебранда были получены у тех больных, которые имели инфекционные осложнения или выраженные проявления оРТПХ в посттрансплантационном периоде. Tsakiris D.A. (1995) исследовав эндотелий-зависимые факторы гемостаза у 44 больных острыми лейкозами после ТКМ пришел к заключению, что у пациентов с оРТПХ, лихорадкой или на фоне лечения циклоспорином отмечены значительно более высокие уровни VIII:C, ФВ и ТПА. Увеличение этих факторов вызывало их дальнейшее высвобождение из эндотелия и/или их синтез, что увеличивало риск посттрансплантационных осложнений.
В обеих нозологических группах отмечалось неуклонное увеличение концентрации ФВ за время наблюдения. Несмотря на то, что во всех измеренных точках значения ФВ у больных с OJIJI превышали соответствующие значения у больных с OMJI, различия эти не были статистически достоверными и не позволили делать заключение о преобладании повреждения эндотелия при той или иной форме острого лейкоза. В то же время темп нарастания изменений был более активным у больных с OMJI. По сравнению с исходным значением после проведенной химиотерапии реакция разных больных значительно отличалась и, несмотря на повышение уровня ФВ, оно было недостоверным. К 14 дню после трансплантации изменения приобретали закономерный и статистически значимый характер (р = 0,05). Эта тенденция переходила в уверенное повышение к моменту восстановления функции гемопоэза у всех обследованных (р = 0,01) с повышением концентрация ФВ в данной группе пациентов более чем 2 раза. В проспективном исследовании параметров гемостаза на 16 пациентах острыми лейкозами после ТКМ, Kanamori Н. et al. (1998) было обнаружено значительное повышение уровней ФВ и тромбомодулина на Д+14 по сравнению с исходными значениями. У больных с РТПХ II-IV (п = 6) отмечен значительно высокий уровень ФВ на Д+14 в сравнении с пациентами с РТПХ 0-1 (п = 10) (р = 0,0062). Эти данные подтверждают теорию о серьёзной эндотелиальной дисфункции после ТГСК.
В группе больных с ОЛЛ закономерности динамики содержания фактора Виллебранда сохранялись. В целом за время наблюдения увеличение концентрации ФВ составило 60% от исходного уровня.
В процессе проведения аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток вне зависимости от вида лейкоза отмечалось значительное увеличение концентрации ФВ. Такое увеличение маркера эндотелиальной дисфункции свидетельствует об активных процессах повреждения эндотелия с самых ранних сроков после трансплантации с сохранением лих изменении вплоть до восстановления гемопоэтической функции. Возможная причина подобных изменений кроется в массивной химиотерапии, а также посттрансплантационных осложнениях, возникающих в раннем периоде у этой группы пациентов.
Увеличение содержания ФВ, который рассматривается не только в качестве показателя страдания эндотелия, но и как маркер активации свертывания крови, свидетельствует о дисбалансе гемостатических процессов, вовлечении сосудистой стенки и увеличении риска тромбообразования после ТГСК. Доступность определения ФВ в условиях клинической лаборатории позволит не только расширить знания относительно эндотелиальной дисфункции, но и своевременно назначать, контролировать и корригировать проводимую терапию, направленную на восстановление поврежденной функциональной активности эндотелиальных клеток у большинства больных с этой патологией.
В рамках выполнения четвертой задачи предпринято определение динамики D-димера как маркера активации свертывания и фибринолиза у больных с острыми лейкозами при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
Активация системы гемостаза, сопровождается появлением в кровотоке специфических маркеров, отражающих степень повышения гемостатического потенциала крови. Одним из них и является Д-димер, как маркер активации коагуляционного каскада. Это связано с участием в его образовании как тромбина, образующегося при активации системы гемокоагуляции, так и плазмина — основного действующего компонента системы фибринолиза. Наличие в плазме здоровых доноров Д-димера свидетельствует о процессах постоянной генерации фибрина и его последующего лизиса. Для появления Д-димера в плазме необходима не только активация свертывания крови и появление внутрисосудистых отложений фибрина, но и возрастание фибринолитической активности крови с последующим расщеплением перекрестного сшитого фибрина.
Предпосылкой для повышения содержания Д-димера у наших пациентов является наличие самого злокачественного новообразовательного процесса. В лабораторной практике в течение мнгих лет Д-димер рассматривался, как дополнительный лабораторный критерий диагностики тромбоза глубоких вен и/или тромбоэмболии легочной артерии. Обладая высокой чувствительностью и относительно низкой специфичностью, это исследование демонстрировало орицательную прогностическую значимость, которая доходит у онкологических больных до 100%. Однако все эти критерии были рассчитаны только для 2 нозологических единиц. Любой случай появления Д-димера должен рассматриваться, как показатель наличия в сосудистом русле перекрестно-сшитого фибрина с последующим его протеолитическим расщеплением сериновой протеазой — плазмином.
При проведении сравнительного анализа в общей выборке, без подразделения по нозологии были получены доказательства активации системы свертывания и наличия в кровотоке Д-димеров. Статистически значимые различия были отмечены на Д0 и Д+14, (р=0,02), а Д+14 и начала функционирования донорского костного мозга, близкие к достоверному (р=0,08). Yenicesu I. et al. (2001) в своем исследовании оценивал коагуляционный статус 29 детей до и после ТКМ. На 7 и 14 дни после ТКМ отмечено значительное повышение Д-димера. Tsakiris D.A. (1991) у 11 пациентов после ТКМ проводил скрининг различных параметров системы гемостаза и выявил статистически значимые повышения уровней ФВ и Д-димера.
При проведении сравнительного анализа в группе больных OMJI статистически достоверных различий не выявлено. В группе больных ОЛЛ напротив — статистически значимые различия были выявлены в трех сравниваемых точках: концентрация Д-димера в Д0 vs концентрация в Д+14 (р=0,01), между Д0 и восстановлением гемопоэза (р=0,0004), а также между Д14 и его концентрацией в момент начала функционирования донорского костного мозга (р=0,01). Разница между обеими группами была близка к достоверной лишь в Д0 (р=Ю,07). К сожалению, данных литературы по динамике Д-димера при различных вариантах острых лейкозов при ТГСК не обнаружено.
Больные с острым лейкозом, перенесшие ТГСК, имели повышенный уровень Д-димера с различной динамикой его в процессе восстановления. В группе больных ОЛЛ высокий уровень Д- димера в Д0 с последующим его снижением и больных с диагнозом ОМЛ в период с Д+14 до момента восстановления может быть наиболее опасным в виду развития дисбаланса в системе плазменного гемостаза с его активацией и формированием тромботических осложнений.
Дальнейшая динамика показателей системы свертывания крови зависит от наличия или отсутствия развивающихся после операции осложнений и является предметом дальнейших исследований. Matsumoto Т. et al. (2004) выявил у пациентов с посттрансплантационными осложнениями значимое повышение плазменных уровней комплекса тромбин-антитромбин, Д-димера и тканевого активатора плазминогена/ингибитора активатора плазминогена 1.
Плазменный уровень Д-димера и тромбомодулина в группе умерших был значимо выше. Результаты позволяют предположить, что отклонения в системе гемостаза помогают предсказать неблагоприятный прогноз при ТКМ.
Важным обстоятельством является статистически достоверная корреляция р=0,039 уровня Д-димера в Д0 в группе больных с ДВС синдромом. Velasco F. et al. (1992) в исследовании на 30 пациентах с ОМЛ достоверно показал, что уровень Д-димера был выше в группе с ДВС (р<0,01),а также была найдена положительная корреляционная связь между уровнем Д-димера и развитием ДВС(р<0,001).
Таким образом, проведенное нами исследование системы гемостаза после ТГСК на основе лабораторных методов выявило отклонения как в системе в целом, так и в отдельных ее компонентах, что помогает понять механизмы и определить наиболее опасные сроки развития посттрансплантационных гемостазиологических осложнений и предпринять своевременные терапевтические меры.